Вырезание определенных сегментов хромосом. Если положение данного гена в хромосоме известно и хромосома достаточно велика, чтобы проводить с ней различные манипуляции, можно выщепить ее часть, которая содержит нужный ген. Этим требованиям удовлетворяют политенные хромосомы слюнных желез Drosophila. Каждая такая хромосома содержит более 1000 копий ДНК, расположенных параллельно друг другу, так что небольшой сегмент может включать 1000 копий определенного гена. Генетические и цитогенетические исследования позволили более или менее точно установить положение многих генов Drosophila. Используя фазово-контрастную микроскопию, можно локализовать область хромосомы, содержащую определенный ген, и вырезать ее тонкой иглой. Таким методом получают сегменты генома длиной около 200 т.п. н., которые далее разрезают рестриктирующими эндонуклеазами и включают в векторные молекулы. Достигаемое при этом обогащение весьма значительно, поскольку на долю 200 т.п. н. приходится лишь около 0,1% от 1,8*108 п. н., составляющих весь геном.
в. Синтетические вставки
Успехи, достигнутые в создании методов химического синтеза, позволили синтезировать из простых нуклеозидов молекулы ДНК длиной до 50 остатков. Такие молекулы, которые трудно получить другим путем, можно затем клонировать и выделить в больших количествах. Например, скрининг определенного гена может оказаться невозможным в отсутствие соответствующего зонда. Однако такой ген можно синтезировать in vitro, если исходя из аминокислотной последовательности соответствующего полипептида установить нуклеотидную последовательность. Именно таким способом были впервые клонированы в клетках Е. coli сегменты, кодирующие гормоны соматостатин и инсулин. Эти сегменты получали, синтезируя отдельные олигонуклеотидные блоки и объединяя их затем при помощи ДНК-лигазы. Было синтезировано восемь коротких одноцепочечных фрагментов ДНК. Их отжигали и получали двухцепочечные молекулы, стабилизированные водородными связями, образующимися между комплементарными концевыми последовательностями. Поскольку все синтетические продукты имели на 5'-концах гидроксильные группы, перед лигированием концы фосфорилировали с помощью полинуклеотидкиназы и АТР. Соответствующие фосфатные группы окрашены. Впоследствии из 66 коротких синтетических фрагментов был воссоздан ген инсулина длиной 514 п. н. Следует отметить, что в связи с вырожденностью генетического кода установление истинной нуклеотидной последовательности гена исходя из известной последовательности аминокислотных остатков в соответствующем полипептиде оказывается невозможным. Тем не менее, удалось определить и синтезировать функциональную кодирующую последовательность.
Синтезировать нуклеотидную последовательность целого гена очень трудно. Однако большую ценность представляет синтез даже коротких участков кодирующей последовательности, поскольку в отсутствие других зондов участки длиной 15-20 нуклеотидов можно использовать в качестве специфических зондов при гибридизации. Синтетические зонды используются при саузерн - и нозерн-гибридизации, а также для скрининга рекомбинантных клонов. Кроме того, короткие синтетические последовательности применяются в качестве праймеров при определении нуклеотидных последовательностей длинных сегментов ДНК, а также при ферментативном синтезе ДНК на молекулах РНК с помощью обратной транскриптазы. Другой важной областью применения описанной технологии синтеза является получение коротких сегментов ДНК, содержащих сайты узнавания для известных рестриктирующих эндонуклеаз. Такие сегменты-линкеры лигируют с тупыми концами фрагментов ДНК, встраиваемых в векторные молекулы.
Прочие статьи:
Завершающий период (150 – 60 до н.э.):
К самостоятельным достижениям римской математики можно отнести лишь создание системы грубо приближенных вычислений и написание нескольких трактатов по геодезии. Наиболее значительный вклад в развитие античной математики на заключительном ...
Сравнительная анатомия
Общий план строения позвоночных животных. Несмотря на крупные различия во внешнем виде, образе жизни и поведении между позвоночными животными, принадлежащими к разным классам, у них можно найти много общего в строении и расположении орган ...
Ритмичность в природе
Природная система характеризуется свойственными ей пространственными и временными ритмами. Под пространственными ритмами понимаются особенности строения системы: расположение в пространстве ее частей, форму и симметрию. В реферате о ритми ...