Вставки
Страница 4

Химический синтез полидезоксинуклеотидов. Для химического синтеза полидезоксинуклеотидов широко применяют два метода. В обоих случаях исходными строительными блоками являются дезоксирибонуклеозиды, и оба метода включают этап связывания мононуклеотидов и олигонуклеотидов. Методы полностью автоматизированы; при этом используется установка "Синтезатор ДНК".

Независимо от метода первым условием является защита тех реакционноспособных групп дезоксинуклеозидов, которые не участвуют в связывании. Так, аминогруппы дезоксиаденозина и дезоксицитозина обычно бензоилируют, а к аминогруппе гуанозина присоединяют остаток изомасляной кислоты. Тимидин, у которого аминогруппа отсутствует, используется немодифицированным.5'-гидроксильные группы обычно защищают путем образования эфирной связи с 4,4'-диметокситрифе-нилметильным соединением, которое называют диметокситритилом, или сокращенно 2Тг. По завершении синтеза все присоединенные группы должны быть удалены. Свободные аминогруппы восстанавливаются при мягком щелочном гидролизе аминоацильных единиц, а диметокситритильные группы удаляются с помощью мягкого кислотного гидролиза.

Фосфаттриэфирный метод. Нуклеозид с присоединенной диметокситритильной группой можно без каких-либо дополнительных модификаций использовать для синтеза фосфодиэфира путем присоединения к З'-ОН-группе, например, и-хлорфенилфосфордихлоридата. Этот диэфир может служить прямым предшественником 5'-конца новой цепи. Далее такой диэфир превращается в триэфир с помощью, например, р-цианоэтанола. Затем 5'-диметокситритиль-ная группа удаляется путем мягкого кислотного гидролиза, в результате чего образуется реакционноспособная 5'-гидроксильная группа. Диэфир и триэфир смешивают в присутствии реагентов, стимулирующих их связывание, обычно арилсульфониловых соединений, например триизопропилбензолсульфонилхлорида. Точный механизм связывания неизвестен. Продуктом реакции является полностью защищенный динуклеотид. При удалении всех защищающих групп образуется простой динуклеозидмонофосфат. Существенно, что полностью защищенный динуклеотид является хорошим исходным продуктом для создания более крупных молекул. При обработке кислотой или ZnBr2 диметокситритиловая группа удаляется и динуклеотид может играть роль З'-конца растущей цепи. При обработке же триэтиламином преимущественно гидролизуется цианоэтиловый эфир, в результате чего динуклеотид приобретает реакционноспособный 3'-конец, который может служить 5'-концом удлиняющейся цепи. Связывание двух динуклеотидов дает тетрануклео-тид. Аналогично соответствующим образом защищенные мононуклеотиды и олигонуклеотиды могут соединяться в длинные блоки. В зависимости от выбора исходного материала синтез цепей ДНК идет в направлении 3'->5' или 5'->3'.

Фосфаттриэфирный метод можно упростить и процесс синтеза ускорить, если фиксировать один из концевых нуклеотидов с помощью гидроксильной группы на твердом носителе. В принципе фиксирована может быть любая гидроксильная группа, но обычно реакция идет лучше, если закреплен 3'-гидроксил. Обычно фиксация осуществляется путем образования эфирной связи между 3'-ОН-группой и карбоксильной группой на носителе, например на пористом стеклянном шарике. В этом случае первый нуклеотид оказывается фиксированным, а 3'-ОН-группа - защищенной. Далее последовательно добавляются нуклеотиды или олигонуклеотиды с 5'-ОН-группами, защищенными диметокситритилом. Перед каждым следующим этапом присоединения диметокситритил удаляется, в результате чего образуется свободная 5'-ОН-группа, по которой может происходить дальнейшее наращивание цепи. По окончании синтеза полидезоксинуклеотид отсоединяют от носителя с помощью щелочного гидролиза. При такой процедуре синтеза не нужно проводить дополнительную очистку после каждого акта наращивания цепи, как при других способах. Метод с использованием фиксации на носителе был автоматизирован, при этом синтез полимера длиной 10-20 нуклеотид занимал несколько суток.

Страницы: 1 2 3 4 5 6


Прочие статьи:

Бактериальные препараты
Наибольшее практическое значение в деле организации борьбы с насекомыми-вредителями как выше было сказано имеет бактерия: В. fburingiensis, она составляет основу современной промышленности по производству бактериальных, инсектицидов. В. ...

Криптококкоз
Криптококкоз (торулез, европейский бластомикоз) - заболевание, вызываемое несовершенными дрожжами базидиомицетового аффинитета Cryptococcus neoformans. Дрожжи этого вида можно встретить в природных местообитаниях, но наиболее часто его об ...

Открытые и закрытые живые системы
Общие замечания Традиционное представление о живой системе как имеющей обмен веществом и энергией с внешней средой является недостаточным и неполным, поскольку не охватывает всей целостной картины жизни. Оно соответствует лишь метаболиче ...

Разделы