Фосфиттриэфирный метод. Основным исходным продуктом в этом случае тоже являются дезоксинуклеозиды с защищенными аминогруппами и 5'-диметокситритило-вой группой.3'-гидроксильная группа концевого нуклеозида защищена путем фиксации ее на твердом носителе с помощью эфирной связи. Предшественником следующего остатка является защищенный дезоксинуклеозид-З'-фосфорамидит, который активируется с помощью тетразола. Скорость процесса и его эффективность зависят от фосфорамидитов, стабильных и эффективно связывающихся, легко синтезируемых агентов. Промежуточным продуктом реакции связывания является фосфит. Он окисляется до фосфата с помощью йода. Как и в предыдущем случае, триэфир защищает новую межнуклеотидную связь от гидролиза во время последующих этапов синтеза. По завершении синтеза цепи удаляют различные защищающие группы и освобождают полидезоксинуклеотид от твердого носителя с помощью щелочного гидролиза. Фосфитный метод с твердыми носителями, полученными на основе силикагелей, применяют при автоматизированном последовательном синтезе олигодезоксири-бонуклеотидов. Присоединение каждого нуклеотидного остатка занимает менее 15 мин, при этом могут синтезироваться цепи длиной до 50 остатков с хорошим выходом.

Ферментативные методы. Ферментативный синтез коротких полидезоксирибонуклеотидов с заданной последовательностью представляется менее сложным, чем химический синтез, и соответствующие процедуры более просты в исполнении. Для ферментативного синтеза не нужно использовать защитные соединения. Однако реакции имеют свои ограничения и с трудом поддаются контролю. При синтезе используется бактериальный фермент полинуклеотидфосфорилаза, специфичный в отношении рибонуклеотидов, но способный катализировать и полимеризацию дезоксирибонуклеотидов, если вместо Mg2+ использовать Мп2+. Субстратами всегда служат дезоксирибонуклеозидфосфаты, при этом никакой матрицы не требуется. К праймерам длиной не менее трех остатков присоединяются за один раз один или два дезоксирибонуклеотидных остатка. Химический и ферментативный методы: могут применяться совместно. При этом используется либо ДНК-полимераза I, либо обратная транскриптаза.

г. Копирование РНК с образованием ДНК

Методы, использующиеся для анализа РНК, менее совершенны, чем аналогичные методы исследования ДНК. Чтобы определить первичную структуру молекулы РНК, проще всего получить с нее ДНК-копию, клонировать эту копию и определить ее нуклеотидную последовательность. Молекулы ДНК, синтезируемые путем ферментативного копирования РНК-матрицы, получили название кДНК. В качестве матриц могут использоваться очищенные РНК или смесь молекул РНК, например мРНК из какой-либо ткани или популяции клеток.

Хорошим источником РНК являются высоко дифференцированные ткани и клетки, продуцирующие в большом количестве определенные мРНК. Например, в первых успешных работах по исследованию семейства овальбуминовых генов, в которых была применена техника работы с рекомбинантными молекулами ДНК, использовали мРНК, выделенную из специализированных клеток, синтезирующих в большом количестве определенные белки. Клонированные кДНК использовались в качестве зондов для выделения соответствующих генов.

Копирование эукариотической мРНК. На первом этапе последовательность мРНК копируют с помощью обратной транскриптазы и получают комплементарную одноцепочечную ДНК. РНК служит матрицей, а в качестве праймера используется короткая последовательность oligo, комплементарно спаренная с oligo на конце РНК. На втором этапе осуществляют деградацию РНК-матрицы либо с помощью рибонуклеазы, либо путем щелочного гидролиза. Затем используют одноцепочечную кДНК в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы I или обратной транскриптазы. На этом этапе праймер не нужен, поскольку на 3'-конце первой структуры временно образуется шпилька варьирующей длины, которая и служит праймером. На последнем этапе эту шпильку разрезают с помощью нуклеазы, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК, и получают дуплексную кДНК.

Прочие статьи:

Какими методами удалось изучить состав живой клетки и ее молекулярное строение? Каковы основные положения и значение клеточной теории в развитии биологии?
За 3 мрд. лет на нашей планете живое вещество развивалось в несколько миллионов видов, но все они – от бактерий до высших животных – состоят из клеток. Клетка – организованная часть живой материи: она усваивает пищу, способна существовать ...

Корни
У корней две основных функции: первая - питать растение, вторая - закреплять его в почве. Действительно, корни поглощают из земли воду и растворенные в ней минеральные соли, таким образом они обеспечивают постоянное снабжение растения вла ...

Исследования К. Линнея
В классической биологии родство организмов, относящихся к разным группам, устанавливали путем сравнения организмов во взрослом состоянии, эмбрионального развития, поиска переходных Ископаемых форм. Современная биология подходит к решению ...