Копирование других РНК. Для получения кДНК на основе геномов некоторых РНК-содержащих вирусов или других молекул РНК, не имеющих на конце oligo, необходимы некоторые ухищрения. В частности, к 3'-ОН-концу РНК можно присоединить участок poly, используя ро1у-полимеразу и АТР. Далее всю последовательность реакций можно проводить так же, как и раньше. Альтернативный подход состоит в отжиге с данной
РНК олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного какому-либо участку молекулы, для образования праймера.
Осложнения. На практике же на каждом этапе, начиная с приготовления очищенного препарата мРНК, возникают сложности, в результате чего конечный продукт обычно представляет собой смесь молекул кДНК, большинство из которых оказываются более короткими, чем полноразмерная РНК. Перечислим некоторые из возникающих проблем.
1. мРНК может частично деградировать при выделении под действием рибонуклеаз.
2. мРНК может копироваться неполностью, в результате чего на 5'-конце кДНК будет недоставать каких-то последовательностей. Чем длиннее молекула РНК, тем больше вероятность, что эта проблема возникнет.
3. Синтез второй цепи ДНК может остановиться прежде, чем кончится матрица, так что З'-конец РНК будет пропущен. Оставшийся конец первой цепи будет удален с помощью нуклеазы, специфичной в отношении одноцепочечных молекул.
4. Нуклеаза может отщепить не только шпильку, но и концы дуплекса.
Все это, а также тот факт, что даже высоко очищенные препараты РНК никогда не бывают абсолютно гомогенными, приводит к тому, что препараты двухцепочечных молекул кДНК всегда представляют собой смесь разных молекул. Разделить такие смеси невозможно ни физическими, ни химическими методами. Однако с помощью молекулярного клонирования кДНК удается получить абсолютно чистые сегменты ДНК.
Серьезные проблемы, возникшие при синтезе полноразмерных копий кДНК на РНК-матрицах с помощью стандартных методов, определили неудачу многих экспериментов. Чтобы решить эти проблемы, пришлось затратить много усилий. Один из путей состоял в отказе от использования нуклеа-зы. В этом случае к З'-концу первой цепи ДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы присоединяли poly и использовали о%о-праймер для синтеза второй цепи.
Метод, в котором устранен главный недостаток, свойственный стандартному методу, - синтез неполных копий РНК. Во-первых, oligo-праймер включается в состав плазмидного вектора Е. coli, так что кДНК может синтезироваться непосредственно на векторе. В результате исключаются этапы выделения и лигирования. Во-вторых, не применяется специфичная к одноцепочечной ДНК нуклеаза, благодаря чему последовательности, соответствующие З'-концу мРНК, не утрачиваются. В-третьих, молекулы ДНК, синтез которых не доходит до конца РНК-матрицы, содержат заглубленный З'-конец, который является неэффективным субстратом для терминирующей трансферазы. При таком подходе получают популяцию рекомбинантных ДНК, обогащенную полноразмерными копиями РНК в виде кДНК, способными осуществлять трансфекцию клеток-хозяев.
Немного модифицировав этот метод, можно получить плазмиды, содержащие молекулы кДНК в форме, способной экспрессироваться в клетках эукариот. Модификация состоит во включении эукариотического промотора и сигналов процессинга РНК в линкерный сегмент.
Прочие статьи:
Обнаружение слепого пятна
Испытуемый фиксирует взгляд на рисунке в виде черного прямоугольника, в левой половине которого находится белый круг, а в правой белый крест. Закрыв правый глаз, испытуемый левым глазом фиксирует крест, расположенный в правой части рисунк ...
Мучнистый червец
Его легко обнаружить, так как он гораздо крупнее паутинного клеща (достигает в длину 5 мм). Но еще более заметны кладки яиц, окутанные как бы комочком ваты. В начальной стадии заражения можно применять механические средства для уничтожени ...
Теория стационарного состояния
Согласно этой теории, Земля никогда не возникала, а существовала вечно; она всегда была способна поддерживать жизнь, а если и изменялась, то очень незначительно. Согласно этой версии, виды также никогда не возникали, они существовали всег ...