Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул
Страница 5

Материалы по биологии » Конструирование, клонирование и отбор рекомбинантных молекул ДНК » Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул

Иммунологический скрининг. Для скрининга рекомбинантной популяции в отношении экспрессии данного гена используют более общий метод, в основе которого лежит иммунологический подход. Синтезируемый белок в этом случае не должен быть функционально активным; необходимы лишь специфические антитела к нему и клетки хозяина, не синтезирующие данный антиген. Антитела взаимодействуют с белковыми молекулами одного клона. Их выявляют по аккумуляции радиоактивности, источником которой служат либо меченые антитела, либо специфические меченые реагенты, узнающие иммуноглобулины.

Было разработано несколько модификаций техники скрининга с участием антител применительно к Е. сой-системам хозяин-вектор. Все они сходны между собой, хотя применяемые приемы зависят, например, от того, какого рода клоны - бактериальные или фаговые-будут тестироваться. В одной из модификаций этого метода антитела равномерно распределяют по поверхности твердого носителя, например пластикового или бумажного диска, и затем прижимают его к агаровому слою, содержащему лизированные колонии или фаговые бляшки. Если специфический антиген синтезируется каким-либо клоном, он будет связываться с антителом на диске. Антиген можно локализовать, обработав снятый с агара диск другими радиоактивно меченными антителами, промыв диск и получив радиоавтограф. Эта процедура зависит от способности двух антител связываться с разными антигенными детерминантами на одном и том же полипептиде. Как и при скрининге путем отжига с ДНК - или РНК-зондами, позитивный клон дает четкое темное пятно на рентгеновской пленке.

Если интересующий нас ген кодирует полипептид, расположенный на поверхности животной клетки, то с помощью высокоспецифических методов можно провести иммунологический скрининг и отбор трансформированных клеток. Поверхностные белки могут взаимодействовать со специфическими антителами, а если эти антитела связываются с какой-либо флуоресцентной меткой, то клетки, синтезирующие данный белок, будут отличаться от других трансформантов по своим флуоресцентным свойствам. Жизнеспособные флуоресцирующие клетки выявляют среди громадного числа нефлуоресцирующих клеток с помощью специального прибора. Далее жизнеспособные клетки размножают и получают популяцию клонированных клеток. Некоторые поверхностные белки являются рецепторами, с которыми связываются специфические лиганды. Если исследуемый ген кодирует такой рецептор, то, используя флуоресцирующий лиганд, можно отделить трансформированные клетки с помощью прибора FACS.

Страницы: 1 2 3 4 5 


Прочие статьи:

Основные этапы развития мира животных на Земле
Развитие мира животных от одноклеточных к многоклеточным. Первыми животными на Земле были древние одноклеточные, от которых произошли современные саркодово-жгутиковые, инфузории, споровики и др. От древних колониальных жгутиковых с животн ...

Рост и размножение прокариот. Кривая роста
Рост микробов – увеличение её m, происходящее в рез-те поступления пит в-в и синтеза из них сложных органических соединен. Под ростом у бакт подразумев не только рост отдельной кл, но и общее увеличение числа кл в рез-те размножения. Дос ...

Чувствительность глаза к свету и цвету. Адаптация
Ощущение света возникает при действии на светочувствительные элементы сетчатой оболочки глаза электромагнитные излучения от 760 до 380 нм. Сетчатая оболочка имеет толщину » 0,5 мм и состоит из нескольких слоев, содержащих волокна зрительн ...

Разделы