Второй метод идентификации рекомбинантных молекул с помощью трансляции in vitro получил название гибридизационной селекции. Из популяции рекомбинантов выделяют и очищают рекомбинантные ДНК. Полученные препараты ДНК подвергают денатурации и каждый из них фиксируют на твердой подложке, например на нитроцеллюлозном фильтре. Каждый из препаратов инкубируют со смесью мРНК. Гибридизация и связывание РНК на фильтре происходят только в тех случаях, когда РНК оказывается комплементарной иммобилизованной клонированной ДНК. Все остальные РНК удаляются с фильтра при промывании. Связанную РНК отделяют от ДНК и тестируют на синтез специфического полипептида в системе трансляции in vitro. Это позволяет идентифицировать соответствующий рекомбинант.
Для облегчения идентификации полипептидов, образующихся при трансляции смеси мРНК in vitro, используют разные методы. Если препарат мРНК обогатить специфической мРНК, то полипептид, кодируемый такой мРНК, иногда удается идентифицировать среди продуктов трансляции по его размеру и количеству. Когда используется сложная смесь мРНК и полипептидов, интересующий нас полипептид можно идентифицировать по его способности взаимодействовать со специфическими антителами. В таких случаях применяют метод белкового блоттинга, аналогичный блоттингу ДНК. При другом подходе нужный полипептид осаждают в присутствии специфических антител из смеси продуктов трансляции in vitro, осадок растворяют и подвергают электрофорезу. В принципе в геле должны присутствовать только два белка - интересующий нас полипептид и иммуноглобулин.
в. Определение экспрессии гена в клетках
Экспрессирующийся ген, входящий в состав рекомбинантной ДНК, при определенных условиях придает клетке-хозяину специфические фенотипические свойства. Метод отбора, основанный на выявлении этого фенотипа, позволяет идентифицировать и выделять соответствующий клон точно так же, как стандартные селективные маркеры в векторных молекулах позволяют отбирать трансформированные клетки. К стандартным селективным маркерным системам, относятся клетки Е. coli, утратившие в-лактамазу, которые используются для отбора трансформантов, содержащих векторы с геном amp, а также клетки млекопитающих, имеющие фенотип ТК-, которые позволяют отобрать трансформанты, содержащие векторы с геном тимидинкиназы. С помощью фенотипического отбора можно отбирать специфические клоны непосредственно из популяций бактерий, дрожжевых или животных клеток, трансформированных смесью рекомбинантных векторов, содержащих различные гены бактерий, дрожжей или животных соответственно. Возможность проведения такого отбора зависит от наличия хозяйских клеток с определенным фенотипом, чаще всего клеток, дефектных в отношении продукта гена, который должен быть клонирован. Если отсутствуют нужные хозяйские клетки, то вместо фенотипического отбора можно использовать иммунологический скрининг. В таких случаях клоны отбирают с помощью антител, специфичных в отношении продукта данного гена.
Фенотипический отбор. Фенотипический отбор из популяции трансформированных клеток - это самый прямой путь выделения нужного клона. На практике этот метод, вообще говоря, ограничивается клонированием прокариотических генов и некоторых генов дрожжей и других грибов в клетках прокариот и эукариотических генов в клетках эукариот. Чтобы клонировать ген А, смесь фрагментов ДНК встраивали в векторные молекулы и трансфицировали ими клетки, мутантные по гену А. Клетки выращивали в условиях, требующих присутствия продукта гена А, так что колонии могли образовывать лишь те клетки, в которых синтезируется продукт гена А, присутствующего в векторе. Наиболее подходящими для проведения такого отбора являются клетки-хозяева, в которых делетирован либо весь ген А, либо его часть. В противном случае приходится выявлять и разграничивать ревертанты и трансформанты. Кроме того, делеционные мутанты исключают вероятность проявления фенотипа А+ в результате супрессии фенотипа А - какими-то другими генами.
Прочие статьи:
Симуляция глухоты
Исследуемый читает вслух книгу. После того как он прочитал несколько предложений, исследователь стучит около его уха коробочкой с кусочками свинца. Исследователь может убедиться, что исследуемый после этого стал читать громче. У глухого ч ...
Нервные механизмы навигации
Одним из важных результатов подобных исследований является получение детальной информации об исходных сенсорных механизмах ориентирования. Поскольку каждая омматидия дорзального ободка содержит два набора фоторецепторов, способных восприн ...
Небесные координаты
Как и на глобусе – уменьшенной модели Земли, на небесной сфере, можно построить координатную сетку, позволяющую определить координаты любого светила. Роль земных меридианов на небесной сфере играют круги склонений, проходящие от северного ...