Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул
Страница 1

Материалы по биологии » Конструирование, клонирование и отбор рекомбинантных молекул ДНК » Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул

а. Обнаружение нужного клона

После разделения рекомбинантных молекул и получения отдельных клонов встает трудно разрешимая задача-обнаружение нужного клона или клонов. Идентификация клона основывается на том, что вставка в рекомбинантной ДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей ее клетки. Это свойство может определяться структурой самой вставки либо быть связанным с ее функцией. На нем основывается скрининг популяции клонов с целью идентификации одного нужного клона. Методы скрининга должны быть очень чувствительными, поскольку иногда приходится идентифицировать один клон из сотен тысяч или даже миллионов клонов.

б. Отжиг с комплементарным полинуклеотидом

Комплементарные одноцепочечные полинуклеотиды, будь то РНК или ДНК, при соответствующих условиях с легкостью ренатурируют, несмотря на присутствие большого избытка неродственных цепей. Благодаря этому исследователь получает мощный инструмент для обнаружения специфической вставки, который можно использовать в разных ситуациях.

Отжиг с радиоактивным зондом. Предположим, что мы имеем большую популяцию клонированных рекомбинантных молекул и проводим отжиг с определенным полинуклеотидным зондом. Тогда мечеными становятся только те рекомбинантные молекулы, которые содержат последовательности, комплементарные зонду. Успех эксперимента зависит прежде всего от наличия нужного зонда.

Для скрининга большого числа колоний, содержащих плазмиды, а также фаговых бляшек разработаны удобные и быстрые методы. На тех же принципах основан и скрининг 8У40-бляшек. Метод состоит в том, что бактериальные колонии или бляшки переносят с агара на иммобилизованную подложку, например на нитроцеллюлозный фильтр, и подвергают содержащуюся в них ДНК денатурации. Затем фильтр инкубируют в растворе, содержащем денатурированный 32Р-ме-ченный зонд, в условиях, способствующих ренатурации комплементарных цепей. Если колония или бляшка содержит ДНК, комплементарную зонду, то на радиоавтограмме в соответствующем месте будет наблюдаться потемнение. Несмотря на то что каждая бляшка или колония содержит лишь небольшое количество ДНК, ее удается выявить благодаря высокой удельной радиоактивности зондов.

Получить большие коллекции клонированных колоний или бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах не составляет труда. Бактерии и дрожжи хорошо растут на самом нитроцеллюлозном фильтре, помещенном на соответствующий питательный агар. Фильтр, содержащий колонии, обрабатывают так, чтобы произошли лизис клеток и денатурация ДНК, отжигают денатурированную ДНК с зондом, идентифицируют бляшки, ДНК которых гибридизовалась, и отбирают клетки из соответствующего участка агара. Фаговые бляшки переносят на нитроцеллюлозный фильтр, наложив его на питательный агар. За один раз на фильтр может быть перенесено до 10000 бляшек с одной чашки диаметром 10 см. Если осторожно снять фильтр, то ДНК из каждой бляшки останется фиксированной на нем. После отжига и идентификации нужных бляшек можно отобрать фаговые частицы из бляшек, оставшихся на чашке с агаром.

Аналогичным образом можно выявить упакованные рекомбинантные молекулы вируса SV40. Питательный агар, покрывающий инфицированный монослой клеток обезьяны, удаляют, весь монослой переносят на нитроцеллюлозный фильтр и идентифицируют нужные бляшки путем отжига с соответствующим радиоактивно меченным зондом. Вирионы, содержащие рекомбинантные ДНК, отбирают из агарового слоя.

Страницы: 1 2 3 4 5


Прочие статьи:

Подотряд удильщиковидные (Lophioidei)
Удильщиковидные – это крупные малоподвижные рыбы с большой уплощённой головой, огромным ртом и огромным желудком. Передний спинной плавник из 6 колючек, первые три колючих луча обособлены друг от друга, а три задние, меньшие, связаны пере ...

Bacillus spp
Все трудности, которые испытывают систематики в определении микроорганизмов, наиболее ярко проявляются в описании Bacillus. Род Bacillus поделен на 48 видов, а виды условно поделены на две группы: 22 вида I группы признаны, а 26 видов II ...

Химические элементы в организме человека
Из 92 имеющихся в природе химических элементов 81 присутствует в организме человека . Минеральные вещества входят в состав всех жидкостей и тканей. Регулируя более 50 000 биохимических процессов, они необходимы для функционирования мышечн ...

Разделы