Экспериментальная часть
Страница 1

Исследования проводили с генетически маркированным штаммом грамположительных бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3157, продуцентом инозина, адаптированным к дейтерию рассевом до отдельных колоний на 2% агаре с 2Н2О и последующей селекции по признаку устойчивости к 2Н2О.

В работе использовали 2Н2О (99.9 ат.% 2Н), 2НСl (95.5 ат.% 2Н) и [U-2H]метанол (97.5 ат.% 2Н) (ЗАО Изотоп, Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, L- глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно перекристаллизовывали в 2Н2О, 2H2O дистиллировали над перманганатом калия с последующим контролем изотопной чистоты 1Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ) (Частота 70 МГц). Масс-спектры электронного удара ЭУ получены на приборе МB-80A (Hitachi, Япония) с двойным фокусированием (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющее напряжение 8 кВ, температура катодного источника 180-2000С) после модификации в метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот по разработанной раннее методике [7]. Масс-спектры FAB получены на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США), снабженным цезиевым источником Cs+ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА. УФ-спектры регистрировали на программируемом спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в диапазоне длин волн 220-280 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге Т-24 (ФРГ) с охлаждением при -40С. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters K-401 (ФРГ) на колонке Separon С18 (250 x 10 мм), элюция смесью ацетонитрил : вода, 75 : 25, об.%, скорость элюирования 0.6 мл/мин. Ионообменную хроматографию осуществляли на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) (230 x 3.2) с сульфированной стирольной (7.25% сшивки) смолой UR-30 (Beckman-Spinco, США); рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи Na+-цитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм. Уровень биоконверсии углеродного субстрата определяли, используя глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4) как описано в работе [35].

Биосинтетический 2Н-меченый инозин.

Получен с выходом 3.9 г/л на синтетической тяжеловодородной среде (89-90% ат. 2Н), используя в качестве источника 2Н-меченых ростовых субстратов гидролизат биомассы метанол-ассимилирующего штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662 (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. 2НСl 30-40 мин при 08 ати), выделенный скринингом в условиях многостадийной адаптации на твердой среде М9 (2% агар) с 2% [U-2Н]метанолом со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации тяжелой воды (от 0 до 98% 2Н2О). Состав синтетической тяжеловодородной среды (мас.%): глюкоза - 12; 2Н-меченый гидролизат B. methylicum - 2; NH4NO3 - 2; MgSO4 .7H2O - 1; Са2СО3 - 2. Синтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой 100 мл) в течение 5-6 сут при 30-320С в условиях интенсивной аэрации реакционной смеси на орбитальном шейкере S-380 (Венгрия).

Очистка

2Н-меченого инозина.Пробы КЖ центрифугировали при 2000 g, 10 мин, концентрировали при 10 мм рт. ст., добавляли ацетон при 00С (3 x 5 мл). Смесь выдерживали 14-15 ч при -40С, осадок отделяли центрифугированием при 1200 g, 5 мин. К супернатанту добавляли 10 г активированного угля, выдерживали 2 сут при 40С. Водную фракцию отделяли фильтрованием, к твердой фазе добавляли 20 мл 50% этанола в 25% аммиаке (1 : 1, об.%), кипятили при 600С с обратным водяным холодильником. Через 2-3 ч смесь фильтровали и упаривали при 10 мм рт. ст. Продукт экстрагировали 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9), промывали ацетоном (2 x 10 мл), сушили над безводным СaCl2. Инозин перекристаллизовывали из 80% этанола, очищали методом ионообменной хроматографии на откалиброванной колонке Biorad (150 x 10 мм) с катионообменной смолой АG50WX 4 (Pharmacia, США), уравновешенной 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) c 0.045 М NH4Cl в условиях изократической элюции (хроматографическая чистота 92%). Контроль чистоты проводили методом ТСХ с использованием стандартного набора рибонуклеозидов фирмы Beckman-Spinco (США) на хроматографических пластинках (150 x 150 мм) с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Чехословакия) в системе растворителей: H-бутанол : уксусная кислота : вода, 2 : 1 : 1, об.%. Выход 2.5 г/л (64%). Т. пл. 68-700С. [a]D20 1.610 (с 1.5 этанол). Rf 0.5. рКa 1.2 (фосфатный буфер, рН 6.87). УФ-спектр

Страницы: 1 2


Прочие статьи:

Архебактерии
Морфологически архебактерии, кратко обозначаемые как археи, не имеют резких отличий от эубактерий. При большом навыке можно отличить их клетки по некоторой угловатости, но эти отличия не выходят, например, за пределы отличий азотобактера ...

Смертоносный яд
Почти у всех пауков имеются ядовитые железы, но из всех обитающих в мире по-настоящему опасны для человека немногие – не больше 3 % от общего числа. Яд паука по –разному воздействует на разных животных. Укус, гибельный для одних, практи ...

Развитие
Чешуекрылые — насекомые с полным метаморфозом. Их яйца очень разнообразны по форме, обычно окрашены, оболочка имеет ложную структуру. Личинок бабочек называют гусеницами. В большинстве случаев они червеобразной формы; тело состоит из гол ...

Разделы