Кинетические исследования ферментативных реакций необходимы не только для количественного определения ферментов и сравнения скоростей их функционирования, но, в еще большей степени, для расшифровки механизмов ферментативных реакций. В этих целях, прежде всего, необходимо уметь корректно вычислять кинетические параметры ферментативных реакций, оценивать конкурентный или неконкурентный характер действия ингибиторов. Рассмотрим основные уравнения, описывающие ферментативную кинетику и способы вычислений. Основное внимание будет уделено не строгости математического вывода уравнений, а правильному их использованию для получения достоверных результатов.

При выводе кинетических уравнений количественно характеризующих ферментативную активность, обычно делают следующие допущения.

1. Фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс за счет сил физической природы. Из этого комплекса в дальнейшем освобождаются фермент и продукт. Таким образом, химической реакцией является только второй этап – распад фермент-субстратного комплекса:

2. Концентрация субстрата обычно значительно выше концентрации фермента. Поэтому при рассмотрении начальных скоростей реакции, когда

3. Константа диссоциации определяется соотношением:

концентрация продукта очень низка, обратимостью второй стадии можно пренебречь. Следовательно, – const., а скорость образования продукта равна:

Поскольку общая концентрация фермента равна сумме концентраций свободного фермента и фермента, связанного в комплекс, то + или = –.

Подставляя значение [Е] = [Е0] — [ES] из (4), получаем:

С другой стороны, из уравнения следует:

В уравнении выражение к+2 можно рассматривать как максимальную скорость, достигаемую, когда концентрация фермент-субстратного комплекса численно равна общей концентрации фермента. Следовательно:

Выражение есть не что иное, как уравнение Михаэлиса–Ментен для ферментативной кинетики, а величина Кга = Ks представляет собой меру сродства фермента к субстрату. Численно она равна такой концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной скорости. Уравнение графически выражается гиперболой.

Для практического определения кинетических параметров этот график неудобен, к тому же требует использования концентраций субстрата, «насыщающих» фермент, что не всегда достижимо при ограниченной растворимости субстрата. Поэтому обычно стремятся преобразовать уравнение Михаэлиса–Ментен в такую форму, чтобы графически оно изображалось прямой линией. Чаще всего для этого используют метод Лайнуивера–Берка, представляя уравнение Михаэлиса–Ментен в виде уравнения прямой линии:

Последнее выражение называют уравнением Лайнуивера–Берка и для расчета кинетических параметров используют график, построенный в координатах: 1/V против 1/S. В результате получается прямая, отсекающая на оси ординат отрезок, равный 1/V, а на продолжении оси абсцисс отрезок, равный – 1/Кга. Однако следует отметить, что при использовании графика Лайнуивера–Берка точки в области высоких концентраций субстрата располагаются слишком густо, а положение прямой линии во многом зависит от точек в области низких концентраций субстрата, где определение скорости менее надежно. Кроме того, реальные экспериментальные данные не всегда адекватно аппроксимируются в виде прямой линии.

Поэтому предложено еще несколько приемов для определения кинетических параметров. Метод Эди–Хофсти также основан на преобразовании уравнения Михаэлиса–Ментен. Умножив обе части уравнения на и преобразовав, получим:

График этого уравнения в координатах V против V/S представляет собой прямую линию, отсекающую на осях ординат и абсцисс отрезки, равные VmaxH Vm>x/ Кго соответственно.

Прочие статьи:

Криптококкоз
Криптококкоз (торулез, европейский бластомикоз) - заболевание, вызываемое несовершенными дрожжами базидиомицетового аффинитета Cryptococcus neoformans. Дрожжи этого вида можно встретить в природных местообитаниях, но наиболее часто его об ...

Закрытые живые системы
Закрытая живая система метаболически неактивна, ей свойственно полное отсутствие активно осуществляемого материального обмена с внешней средой. Это определяет отсутствие всех прочих жизненных функций и сводит жизненный процесс к существов ...

Концепция стационарного состояния
Концепция стационарною состояния заявляет о том, что проблемы зарождения жизни вообще не существует. Некоторые ученые, среди которых был и В.И. Вернадский, заявляли, что жизнь на Земле (как и сама Земля) никогда не возникала, а существова ...