Метод микроинъекции
Страница 1

Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве.

Суть метода микроинъекции заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот. Обычно инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК в концентрации, соответствующей 1000 копиям в 1 пкл микроинъекционного раствора. При этом исходят из того, что количество 1000 копий/пкл приблизительно соответствует концентрации X нг/мкл, где X - длина генной конструкции в тысячах парах нуклеотидов (т.п.н). Например, если длина генной конструкции равна 10 т.п.н., то количество 1000 копий в 1 пкл будет достигаться при концентрации равной 10 нг/мкл.

Для более точного расчета концентрации генных конструкций используют следующую формулу:

Число копий (копий плк) = 6,023 *1023*С*10-9 /Mr, где 6,023*1023 - число копий в 1 М растворе;

С - концентрация ДНК [мкг/мл];

Mr - молекулярная масса [мг/моль].

Для расчета концентрации измеряют оптическую плотность раствора генной конструкции на спектрофотометре при длине волны 260 нм. 1 OD соответствует концентрации двуточечной ДНК равной 50 мкг/мл. При расчете молекулярной массы исходят из того, что молекулярная масса 1 п.н. равна 6,6 * 108 мг/моль.

Об успешном выполнении микроинъекции судят по увеличению объема пронуклеуса в 1,5-2 раза [Брем и др., 1995]. В эмбрионах мышей кроликов, овец и коз пронуклеусы достаточно хорошо визуализируются под микроскопом при увеличении х400 без выполнения каких-либо дополнительных манипуляций. Что касается эмбрионов свиней и крупного рогатого скота, то вследствие наличия в цитоплазме темных липидосодержащих гранул определение местоположения пронуклеусов в них затруднено. Для смещения этих гранул к краям эмбриона и облегчения тем самым локализации пронуклеусов выполняют центрифугирование эмбрионов свиней и КРС при 15000 об/мин в течение 3 мин. [Wall et ai, 1985]. По завершении микроинъекции эмбрионы культивируют несколько часов до момента их пересадки в яйцевод синхронизированных реципиентов. Эмбрионы КРС культивируют in vitro в течение 6-7 дней до достижения ими стадий морулы или бластоцисты и затем выполняют пересадку в матку синхронизированных реципиентов. После рождения от всех животных отбирают пробы ткани для анализа на интеграцию трансгена. Степень интеграции, то есть число трансгенных животных от общего числа родившихся животных, при использовании метода микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначительных пределах. Так, у мышей этот показатель в среднем составляет 15%, у свиней - 10-15%, у кроликов - 10%, у овец, коз и КРС -5-10% [Брем и др., 1995]. Наиболее важным, с точки зрения затрат, требующихся для получения одного трансгенного животного, является показатель общей эффективности трансгенеза, который рассчитывается как отношение числа полученных трансгенных животных к общему числу пересаженных эмбрионов, выраженное в процентах. Величина этого показателя также относительно постоянна и составляет у мышей -2%, у кроликов 1%, у овец и коз – 0,5 – 1%, у свиней и КРС – 0,5%. На частоту интеграции оказывает влияние степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора, качество эмбрионов, способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический). При использовании раствора MSOF(синтетическая среда эмбрионов) для микроинъекции зигот крупного рогатого скота (Hageman [1995]) было показано, что инъекция раствора MSOF не оказывала влияния на жизнеспособность эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro. Так, доли эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, в группах MSOF и контрольной составляли, соответственно, 27,6% и 27,5%. В группе ТЕ до стадии бластоцисты развились лишь 13,9% инъецированных зигот. Сопоставляя результаты двух приведенных выше исследований, можно предположить, что буфер MSOF окажется более эффективным по сравнению со стандартным раствором ТЕ для получения трансгенного крупного рогатого cкота и других видов сельскохозяйственных животных.

Страницы: 1 2


Прочие статьи:

Самоорганизация в открытых неравновесных системах
Проблема самоорганизации материальных систем в XX веке становится одной из центральных проблем науки. Существенный вклад в решение этой проблемы вносит системный и информационный подходы. Терминология, выработанная в этих областях исследо ...

Обзор видового состава вересковых (Ericaceae) Красноселькупского района
Багульник (Ledum). Русское название "багульник" происходит от старинного глагола "багулить", что означает "отравлять". В русском названии отображена характерная особенность этого кустарника – сильный, удушающ ...

Выводы
В работе были рассмотрены основные теории происхождения жизни на Земле. На данное время нельзя однозначно трактовать происхождение жизни только как акт творения или как процесс эволюции. Поскольку есть доказательства как одной, так и втор ...

Разделы