Полученный результат требовал изучение содержания глюкозы в биомассе штамма после гидролиза, осуществленное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 3). Смесь гидролизных сахаров в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки) составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды (мальтоза, сахароза), а также четыре других неидентифицированных сахара с временами удерживания 3.08 (15.63%), 4.26 (7.46%), 7.23 (11.72%) и 9.14 (7.95%) мин (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21.4% от сух. веса, то есть выше, чем фруктозы (6.82%), рамнозы (3.47%), арабинозы (3.69%) и мальтозы (11.62%). Их выхода существенно не отличались от контроля на Н2О, за исключением сахарозы, не детектируемой в дейтерированном гидролизате.

Таблица 3.

Состав сахаров гидролизата штамма-продуцента

Сахар Выход, % от сухого веса 1 г биомассы протонированная среда тяжеловодородная среда
Глюкоза	20.01	21.4
Фруктоза	6.12	6.82
Рамноза	2.91	3.47
Арабиноза	3.26	3.69
Мальтоза	15.3	11.62
Сахароза	8.62	-

Применение сложных физико-химических методов для выделения биосинтетически 2Н-меченого инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высокой степени хроматографической чистоты. Поскольку в КЖ наряду с синтезируемым продуктом присутствуют примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, а также сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводили ступенчатое фракционирование КЖ. Повышенная чувствительность инозина к кислотам и щелочам и его нестабильность при выделении диктовали использование кислотных и щелочных растворов низкой концентрации, а также по-возможности проводить выделение при низких температурах, избегая длительного перегрева реакционной смеси. Фракционирование КЖ заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом, твердофазной адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстрактивного извлечения продукта, перекристаллизации и ионообменной хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемператрным осаждением ацетоном при -40С, проводя последующую адсорбцию суммы рибонуклеозидов активированным углем на холоду. Десорбированные рибонуклеозиды извлекали из прореагировавшей твердой фазы элюцией этанольно-аммиачным раствором при 600С, а сам инозин экстракцией 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле. Окончательная стадия очистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0.3 М NH4-формиатным буфером с 0.045 М NH4Cl с ТСХ контролем при Rf 0.5. Данные по выделению инозина из КЖ штамма-продуцента представлены в виде спектров УФ-поглощения на рис. 4, а-в. Наличие в синтетическом образце (в) основной полосы поглощения I, соответствующей нативному инозину (lmax 249 нм, e249 7100 М-1 см-1) и отсутствие вторичных метаболитов II и III неоспоримо доказывает его однородность и тем самым эффективность разработанного метода выделения со степенью хроматографической чистоты 92%.

Прочие статьи:

Нормальная сегментация у дрозофилы
После оплодотворения и слияния гамет у зародыша дрозофилы наблюдается ряд синцитиальных делений дробления, т.е. деления ядер, не сопровождающиеся образованием клеток зародыша. Первые девять таких делений происходят по всей цитоплазме яйца ...

Фотосинтетическое питание и коррелятивное наследование – два ключевых свойства первоначальной жизни
Слишком наивным было бы также считать, что хлорофилл возник однажды сразу в результате какой-то чудесной мутации в уже процветающем живом организме, это невозможно хотя бы из-за слишком большой сложности этого соединения. Фотосинтез, то е ...

Чайный гриб - натуральное косметическое средство
Настой чайного гриба является естественным природным средством ухода за кожей. Он стимулирует выделительные функции кожи, улучшает кровообращение, разглаживает и тонизирует кожу. Этот продукт находит на удивление разнообразное косметическ ...