Уравнение Скэтчарда в этом случае принимает вид

Варьируя концентрацию антител в системе при постоянной концентрации о, можно определить константу комплексообразования К и число мест связывания 6 антигене п.

Так как молекулы антител обладают, по крайней мере, двумя центрами связывания, то при взаимодействии с поливалентным антигеном возможно образование так называемых комплексных связей, когда после взаимодействия одного активного центра молекулы антитела с одним из эпитопов второй активный центр взаимодействует с расположенным поблизости вторым эпитопом той же молекулы антигена. Общая эффективность взаимодействия в этом случае существенно возрастает; в частности, эффективная константа комплексообразования для молекулы IgG может в 103 раз и более превышать Ко одиночных связей. Частота образования таких связей зависит от концентрации реагентов и может колебаться от нуля до максимальной, соответствующей общему количеству молекул IgG в Системе.

Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном. Одним из простых приближений при описании реальных систем взаимодействия моновалентного антигена с антителами может быть модель, согласно которой набор популяций антител заменяется двумя — высокоаффинной и низкоаффинной, каждая из которых характеризуется собственной константой комплексообразования — Кй и Кг. Задача определения констант и концентраций каждой из фракций антител перед экспериментаторами возникает часто. Знание численных значений этих параметров весьма важно для разработки конкретных наборов для иммуноферментного анализа и выбора схемы проведения иммуноанализа с целью достижения требуемой чувствительности определения антигена и специфичности анализа.

В условиях равновесия рассматриваемая схема взаимодействия

описывается системой следующих алгебраических уравнений:

Опуская алгебраические преобразования, дадим окончательное выражение зависимости, описывающей связь параметров системы в координатах Скэтчарда:

где В = Вй-\-В2=+; F=. Графическая зависимость B/F от В имеет вид гиперболы. Таким образом, получаемая при анализе зависимости связывания неизвестной популяции антител с антигеном в координатах Скэтчарда вогнутая кривая может свидетельствовать о существовании двух фракций антител — высокоаффинной и низкоаффинной.

Для определения четырех неизвестных параметров — Кй, Кг, 0 и о можно воспользоваться одним из следующих методов.

1. Параметры можно оценить по углам наклона асимптот гиперболы и отрезкам, отсекаемым ими на оси абсцисс и ординат. Для построения асимптот используют следующий прием. По концевым участкам экспериментальной кривой проводят прямые, которые дают первоначальное приближение констант Кй и Кя.Путем параллельного перемещения прямых подбирают такое их положение, чтобы сумма отрезков, отсекаемых ими на осях координат', была равна соответствующим отрезкам на тех же осях, отсекаемых самой кривой при экстраполяции ее к осям координат:

Отрезки на оси абсцисс ОМ и оси ординат CW дают оценочные значения для 0 и о соответственно. Подставляя оценочные значения Кй, Кз, 0 в выражения для Вй и В2

находят приближенные параметры В\ и В% и В=В1-\-В2 при различных концентрациях Аг.

С использованием полученных значений строят теоретическую зависимость B/F от В, сравнивают ее с экспериментальной и подбирают новые оценочные параметры до наилучшего совпадения теоретической и экспериментальной кривой.

2. Для нахождения асимптот гиперболы можно воспользоваться чисто графическим методом, заключающимся в построении двух прямых PQ и НМ, для которых выполняется соотношение

т. е. отрезок OR, соединяющий начало координат с любой точкой R, находящейся на гиперболе, равен сумме отрезков ORi и OR2, соединяющих начало координат с точками пересечения отрезка OR с асимптотами.

3. Для оценки параметров Ки Кг, п и о часто используют следующий метод, основанный на анализе графической зависимости B/F от В. Из экспериментально полученной кривой связывания путем экстраполяции находят точки пересечения кривой с осями абсцисс и ординат. Проводят касательные в этих точках к кривой до пересечения их с осями абсцисс и ординат в точках D и Е„

Прочие статьи:

Приготовление окрашенных препаратов
Обработка предметного стекла. Прежде чем приступить к приготовлению микроскопических препаратов необходимо предметные и покровные стекла, Они должны быть чистыми и обезжиренными. Доказательства хорошего обезжиривания является равномерное ...

Создание классической механики и экспериментального естествознания
Трагическая гибель Джордано Бруно произошла на рубеже двух эпох: эпохи Возрождения и эпохи Нового времени. Последняя охватывает три столетия - XVII, XVIII, XIX вв. В этом трехсотлетнем периоде особую роль сыграл XVII век, ознаменовавшийся ...

Определение содержания витаминов в растительных клетках
С помощью флуоресцентной микроскопии возможно определение содержания витаминов в образцах, благодаря их собственной флуоресценции и с применением флуорохромов. Во многих случаях этот метод даёт лучшие результаты, чем самый тонкий химиче ...