Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген — антитело
Страница 2

Материалы по биологии » Аффинность антител и кинетика реакций » Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген — антитело

Уравнение Скэтчарда в этом случае принимает вид

Варьируя концентрацию антител в системе при постоянной концентрации о, можно определить константу комплексообразования К и число мест связывания 6 антигене п.

Так как молекулы антител обладают, по крайней мере, двумя центрами связывания, то при взаимодействии с поливалентным антигеном возможно образование так называемых комплексных связей, когда после взаимодействия одного активного центра молекулы антитела с одним из эпитопов второй активный центр взаимодействует с расположенным поблизости вторым эпитопом той же молекулы антигена. Общая эффективность взаимодействия в этом случае существенно возрастает; в частности, эффективная константа комплексообразования для молекулы IgG может в 103 раз и более превышать Ко одиночных связей. Частота образования таких связей зависит от концентрации реагентов и может колебаться от нуля до максимальной, соответствующей общему количеству молекул IgG в Системе.

Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном. Одним из простых приближений при описании реальных систем взаимодействия моновалентного антигена с антителами может быть модель, согласно которой набор популяций антител заменяется двумя — высокоаффинной и низкоаффинной, каждая из которых характеризуется собственной константой комплексообразования — Кй и Кг. Задача определения констант и концентраций каждой из фракций антител перед экспериментаторами возникает часто. Знание численных значений этих параметров весьма важно для разработки конкретных наборов для иммуноферментного анализа и выбора схемы проведения иммуноанализа с целью достижения требуемой чувствительности определения антигена и специфичности анализа.

В условиях равновесия рассматриваемая схема взаимодействия

описывается системой следующих алгебраических уравнений:

Опуская алгебраические преобразования, дадим окончательное выражение зависимости, описывающей связь параметров системы в координатах Скэтчарда:

где В = Вй-\-В2=+; F=. Графическая зависимость B/F от В имеет вид гиперболы. Таким образом, получаемая при анализе зависимости связывания неизвестной популяции антител с антигеном в координатах Скэтчарда вогнутая кривая может свидетельствовать о существовании двух фракций антител — высокоаффинной и низкоаффинной.

Для определения четырех неизвестных параметров — Кй, Кг, 0 и о можно воспользоваться одним из следующих методов.

1. Параметры можно оценить по углам наклона асимптот гиперболы и отрезкам, отсекаемым ими на оси абсцисс и ординат. Для построения асимптот используют следующий прием. По концевым участкам экспериментальной кривой проводят прямые, которые дают первоначальное приближение констант Кй и Кя.Путем параллельного перемещения прямых подбирают такое их положение, чтобы сумма отрезков, отсекаемых ими на осях координат', была равна соответствующим отрезкам на тех же осях, отсекаемых самой кривой при экстраполяции ее к осям координат:

Отрезки на оси абсцисс ОМ и оси ординат CW дают оценочные значения для 0 и о соответственно. Подставляя оценочные значения Кй, Кз, 0 в выражения для Вй и В2

находят приближенные параметры В\ и В% и В=В1-\-В2 при различных концентрациях Аг.

С использованием полученных значений строят теоретическую зависимость B/F от В, сравнивают ее с экспериментальной и подбирают новые оценочные параметры до наилучшего совпадения теоретической и экспериментальной кривой.

2. Для нахождения асимптот гиперболы можно воспользоваться чисто графическим методом, заключающимся в построении двух прямых PQ и НМ, для которых выполняется соотношение

т. е. отрезок OR, соединяющий начало координат с любой точкой R, находящейся на гиперболе, равен сумме отрезков ORi и OR2, соединяющих начало координат с точками пересечения отрезка OR с асимптотами.

3. Для оценки параметров Ки Кг, п и о часто используют следующий метод, основанный на анализе графической зависимости B/F от В. Из экспериментально полученной кривой связывания путем экстраполяции находят точки пересечения кривой с осями абсцисс и ординат. Проводят касательные в этих точках к кривой до пересечения их с осями абсцисс и ординат в точках D и Е„

Страницы: 1 2 3


Прочие статьи:

Выращивание веслоноса
Выращивание молоди веслоноса необходимо проводить в три этапа. Первый этап — выдерживание, перевод на смешанное питание, подращивание до массы 200-300 мг, осуществляемое в бассейнах, лотках, аппаратах «Амур», установках замкнутого водосн ...

Этапы биосинтеза
Транскрипция — процесс биосинтеза всех видов РНК на матрице ДНК, который протекает в ядре. Определенный участок молекулы ДНК деспирализуется, водородные связи между двумя цепочками разрушаются под действием ферментов. На одной цепи ДНК, ...

Яд скорпионов
Потревоженный или подвергшийся нападению скорпион тут же пытается ужалить обидчика. Есть два основных вида их яда. Первый может убить или парализовать беспозвоночное, но для человека, он не более опасен, чем укус осы, и может вызвать тол ...

Разделы