Наряду с низкой эффективностью большинства методов трансгенеза основным лимитирующим фактором получения трансгенных является случайный характер интеграции трансгена в геном. На экспрессию трансгена в организме животных оказывают влияние последовательности, прилегающие кв участку интеграции, что является причиной большой вариабельности уровня экспрессии. Уровень синтеза трангенного продукта может варьировать у различных животных от эктопного до слабого или даже находится ниже порога детекции.
Влияние участка интеграции на уровень и характер экспрессии объясняется так называемым позиционным эффектом [Wilson era/., 1990, Sippel et al., 1997). Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmlter, Brinster, 1986].
Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий.
Первым таким подходом, позволившим увеличить уровень экспрессии, являлось введение в генные конструкции гомологичных интронных последовательностей.
Положительное влияние на уровень экспрессии трансгенов оказывало введение в генные конструкции S/MAR-элементов
Наиболее удачным решением проблемы преодоления позиционного эффекта явилось интеграция в определенный участок генома посредством гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках, так как это обеспечивает контроль трансгенной конструкции всеми регуляторными последовательностями, присутствующими в выбранном эндогенном локусе. Оптимальная локализация трансгенов в геноме клетки хозяина может быть выбрана исходя из уровня и характера экспрессии экспериментального трансгена. Еще одним подходом, позволившим дайной интеграции трансгена в геном хозяина является включение в генные конструкции всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию. Стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не могут быть использованы, вследствие их ограниченной емкости. Данная стратегия может быть использована с применением векторов типа искусственных хромосом, обладающих повышенной клонирующей способностью.
Наиболее широкое применение для получения трансгенных животных нашли векторные системы на основе YAC (обзоры Montoliuetal. 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson etal 1997) YAC- эукариотические клонирующие векторы, способные к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной более 1 миллиона п.о. [Burke., 1987]. Они представляют собой линейные фрагменты ДНК, содержащие все необходимые элементы для их сохранения в клетках дрожжей в виде искусственных хромосом. Первые результаты успешного использования YACs в экспериментах по трансгенезу на мышах были получены в 1993 году [Jakobovits et a/., 1993, Schedl et a/., 1993, Strauss etal., 1993].
Для введения YACs в эмбрионы мышей нашли применение три различных подхода: пронуклеарная микроинъекция очищенной в геле YAC-ДНК [Schedl et a/., 1993], липофекция YAC-ДНК в эмбриональные стволовые клетки [Strauss et a/., 1993] и слияние дрожжевого сферобласта с эмбриональными стволовыми клетками [AtoboWte ef a/., 1993). Исследование экспрессии YACs у различных линий трансгенных мышей выявило зависимость уровня экспрессии от числа копии трансгена. С другой стороны, уровень экспрессии не зависел от позиционного эффекта
В то время, как YAC-технологии широко используются для получения трансгенных мышей [обзоры Peterson et al., 1997, Giraldo and Montoliu, 2001) Несколько исселдователай сообщили об успешном создании YAC-трансгенных сельскохозяйственных животных. Были получены свиньи и крысы посредством ксенотрансплатации и направленной экспрессией рекомбинантных генов в молоко трансгенных животных.
Прочие статьи:
Г) Микоплазменные болезни.
Распространены во всех зонах картофелеводства. Вызывают их микроскопические организмы - фитопатогенные микоплазмы. Резко снижают урожай и качество клубней. Наиболее вредоносны столбурное увядание (столбур), пурпурность верхушки, «ведьмины ...
Наблюдение
Наблюдение есть чувственное отражение предметов и явлений внешнего мира. Это — исходный метод эмпирического познания, позволяющий получить некоторую первичную информацию об объектах окружающей действительности.
Научное наблюдение (в отл ...
Пигменты хлоропластов
Пигменты — важнейший компонент аппарата фотосинтеза. Изучение растительных пигментов резко ускорилось благодаря работам русского физиолога растений М. С. Цвета. Пытаясь найти способ разделения пигментов на индивидуальные вещества, Цвет в ...