Использование ретровирусных векторов
Страница 3

Материалы по биологии » Получение трансгенных животных » Использование ретровирусных векторов

Преимуществом использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является то, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно инфицированы ретровирусами.

Недостатком применения ретровирусных векторов является их ограниченная емкость (размер вставки не должен превышать 8 тысяч п. н. Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов вырезаются интроннные последовательности, которые как и другие дистальные или проксимальные последовательности играют важную роль в эффективной экспрессии генов у трансгенноых животных [Palmiter et ai, 1991]. К недостаткам использования ретровирусных векторов следует так же отнести подавление экспрессии трансгенов in vivo вследствие инактивации вирусных промоторов в клетках, например, посредством а- и у-интерферонов, действующих на вирусные LTR [Ghazizadeh et ai, 1997]. Однако данная проблема может быть решена посредством включения в ретровирусную конструкцию внутренних промоторов или использованием нового поколения ретровирусов, содержащих модифицированные участки контроля экспрессии, такие как внутренний рибосомный сайт (IRES) [Salen, 1997] и тетрациклиновая регуляторная система [lida et ai, 1996].

Еще одним ограничением использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является их низкий титр. Обычные ретровирусные векторы имеют титр 1 х 105-6 колониеобразующих единиц (cfu) в мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низкий титр ретровирусов ограничивает способы их введения в эмбрионы. Проблема низкого титра была недавно решена посредством разработки нового вектора на основе вируса везикулярного стоматита (псевдотип VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Известно, что тропизм ретровируса определяется геном env, поэтому его замена в векторе на ген env другого ретровируса может расширить спектр хозяев и изменить свойства ретровируса. Данная технология получила название псевдотипирования. Включение белка вируса везикулярного стоматита С в вектор на основе Мо – MLV (Burns et al,1994) позволило сделать его более стабильным при ультрацентрифугировании. Данный вектор может быть сконцентрирован до титра 1x109-10 КОЕ/мл и имеет очень широкий спектор клеток-хозяев. С его использованием были получены трансгеные лини клеток насекомых, млекопитающих, амфибий, рыб, а также созданы трансгенные животные. Высокий титр ретровируса сделал возможным получение трансгенных животных посредством инъекции содержащей вирусы среды в перивителиновое пространство [Chan et al, 1998)/ В ооцитах крупного рогатого скота объем перивителинового пространства составляет 200-300 пкл. При использовании вируса с титром 1*10 9-10 КОЕ/мл, инъекция 10 пкл приводит к проникновению в перивителиальное пространство от 10 до 100 инфекционных вирусных частиц. Если титр вируса равен 1*105-6 КОЕ/мл, то для введения в эмбрион одной вирусной частицы понадобилось не менее 1 нл раствора .

К недостаткам использования ретровирусов относится возможность клеточных онкогенов посредством вирусных транскрипционных последовательностей. Даже при применении ретровирусов, которые не могут существовать как инфекционные вирусные частицы, существует хотя и очень небольшой, но риск, что при рекомбинации с присутствующими в эмбрионах эндогенными ретровирусными последовательностями могут образовываться новые активные формы ретровирусов.

Не смотря на перечисленные недостатки и ограничения, ретровирусы могут быть широко использованы для трансгенеза в животноводстве. Успешное введение генетического материала в ооциты делает возможным проведение генной терапии наследственных заболеваний. Использование ретровирусных векторов позволяет осуществлять трансформацию отдельных органов. Так, Archer с соавторами [1994] ввели в молочную железу козы путем инфузии через сосковый канал в период гормонально индуцируемого маммогенеза ретровирус, кодирующий гормон роста человека (hGH). Лактация наступила на 14-ый день гормональной обработки. Максимальный уровень hGH (60 нг/мл) наблюдался в первый день лактации и затем опускался до 12 нг/мл на 9-12 дни лактации.

Аналогичные эксперименты с использованием экспрессионного вектора pLNS, полученного на основе Mo-MLV проводятся в отделе биотехнологии Всероссийского НИИ животноводства.

Страницы: 1 2 3 4


Прочие статьи:

Нотокактус (Notocactus)
Семейство кактусовых. Родина — Бразилия, Парагвай, Боливия и Аргентина. Нотокактусы по современной классификации относят к пародиям. Раньше Нотокактусы выделялись в отдельный небольшой род, включающий в себя несколько видов. Большинство и ...

Пивоварение
Технология приготовления пива включает несколько этапов. Пиво производят из зерна, которое в отличие от винограда содержит в основном крахмал, плохо усваиваемый дрожжами. Поэтому перед сбраживанием этот крахмал необходимо осахарить (гидро ...

Тактильная чувствительность
Исследуемый вытягивает руки вперёд и закрывает глаза, раскрывает ладони вверх, а исследователь одновременно, без нажима опускает ему на ладони обоих рук груз массой от 1 до 5 гр. Изменяя соотношение веса груза, находящегося на ладони, ис ...

Разделы