Активность КПН определяли флюорометрическим методом Fricker и Snyder [153].
Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.
Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин.
Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Для определения активности ФМСФ-ингибируемой КП 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мМ ингибитора ФМСФ, приготовленного на этаноле, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером (в случае контрольной пробы). Пробы преинкубировали 8 мин при 37˚С, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH. Активность фермента определяли как разницу в приросте флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Концентрацию белка определяли методом Лоури [80].
Прочие статьи:
Краткая характеристика ноосферы
Учение о ноосфере возникло в рамках космизма – философского учения о неразрывном единстве человека и космоса, человека и Вселенной, о регулируемой эволюции мира. Понятие ноосферы как обтекающей земной шар идеальной, «мыслящей» оболочки, ф ...
Malassezia
Дрожжи рода Malassezia - облигатные симбионты человека и теплокровных животных, обитающие на поверхности их кожи и на волосяном покрове. В других местообитаниях эти организмы не встречаются. Первые описания этих грибов относятся к середин ...
Человек как примат
Парадокс внутреннего сходства и внешнего различия
Для современной биологии, исключившей из своего арсенала такое понятие, как специальный замысел Творца, совершенно непонятно, почему при столь близком биохимическом составе тела человека ...