Лигирование вектора со вставкой
Страница 1

После того как получены вектор и вставка, можно приступать к конструированию рекомбинантных ДНК. Обычно нужно осуществить только два двухцепочечных соединения независимо от того, представляет ли собой вектор линейную плазмиду или вирусный геном или два плеча ДНК фага X объединены в одну линейную молекулу по cos-сайтам. Если вставки имеют тупые концы, то перед лигированием для его облегчения к ним часто присоединяют липкие концы.

а. Соединение концов

Рассмотрим четыре возможные ситуации: вектор и вставка имеют полностью совпадающие липкие концы; две разные пары совпадающих

концов; тупые концы; пару совпадающих липких и пару тупых концов. Структура вектор-вставка, в которой каждый из компонентов содержит один липкий и один тупой концы, может образоваться только одним способом. То же самое относится к случаю, когда вектор и вставка имеют по два разных совпадающих липких конца. В тех же случаях, когда каждая молекула имеет два идентичных липких конца или два тупых конца, вставка может быть встроена в любой из двух возможных ориентации относительно вектора, в результате чего образуются два разных продукта. Липкие концы вектора и вставки соединяют с помощью ДНК-лигазы в условиях, способствующих образованию водородных связей между комплементарными участками. Для объединения тупых концов ДНК-лигаза Т4 и фрагменты должны присутствовать в высоких концентрациях, поскольку лигаза имеет низкое сродство к тупым концам.

Помимо лигирования вектора и вставки может происходить внутримолекулярное лигирование этих двух компонентов, в результате чего выход ре-комбинантных молекул снижается. Вероятность таких побочных реакций можно уменьшить, проводя перед лигированием дефосфорили-рование либо вектора, либо вставки. В отсутствие 5'-фосфомоноэфирных групп внутримолекулярное лигирование осуществляться не может. Обычно дефосфорилируют векторную молекулу, чтобы свести к минимуму ее способность к амплификации после трансфекции. Вставка, замкнувшаяся в кольцо, не способна к репликации, поэтому с ней возникает меньше проблем. Рекомбинантная молекула, образовавшаяся из дефосфорилированной векторной молекулы, содержит по одному пробелу в каждой из цепей. Такие молекулы легко репарируются в клетках соответствующих хозяев.

б. Присоединение липких концов

Встраивание сегментов ДНК в векторные молекулы облегчается, если эти сегменты и вектор имеют одинаковые липкие концы. Существуют два удобных способа образования липких концов у сегментов ДНК с тупыми концами: образование одноцепочечных "хвостов" и введение сайтов рестрикции.

Образование одноцепочечных "хвостов". Если с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы нарастить каждый из 3'-гидроксильных концов двухцепочечной вставки с тупыми концами и присоединить комплементарные нуклеотиды к концам линейной векторной ДНК, то при отжиге образуется кольцевая рекомбинантная молекула. Если размер "хвостов" одинаков, то концы легко сшиваются ДНК-лигазой. Однако такая ситуация встречается редко, поэтому перед лигированием бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I. Напомним также, что для терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы требуются одноцепочечные З'-гидроксильные концы в качестве праймеров и что для эффективного наращивания дуплексных молекул ДНК с тупыми концами или молекул, у которых З'-гидроксильные концы заглублены, необходимы особые условия.

Введение сайтов рестрикции. Короткие фрагменты ДНК с тупыми концами, содержащие последовательности с сайтами для специфических рес-триктирующих эндонуклеаз, получают путем химического синтеза. Структуры двух таких "линкеров" и способ получения с их помощью липких концов у вставки с тупыми концами. Соединение линкера со вставкой катализируется Т4-лигазой. Затем эту ДНК обрабатывают соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой, чтобы получить липкие концы. На этом последнем этапе возникают проблемы. Если фрагмент, к которому присоединены линкеры, содержит сайт узнавания для используемого фермента, то образование липких концов приводит к нарушению целостности фрагмента. Эту проблему можно решить двумя способами. Первый состоит в использовании другого линкера. Второй основан на защите внутренних сайтов путем метилирования с помощью метилазы, специфичной в отношении данного сайта.

Страницы: 1 2


Прочие статьи:

Энергетический обмен
Энергетический обмен состоит из трех этапов. I этап — подготовительный. На первом этапе происходит расщепление высокомолекулярных органических веществ до низкомолекулярных в процессе реакций гидролиза, идущих при участии воды. Он протек ...

XX век
Клеточная теория со второй половины XIX века приобретала всё более метафизический характер, усиленный «Целлюлярной физиологией» Ферворна, рассматривавшего любой физиологический процесс, протекающий в организме, как простую сумму физиологи ...

Понятие «ген». Развитие представлений о нем.
Ген – функциональная единица наследственного материала. Ген (от греч. genos — род, происхождение) – участок молекулы геномной нуклеиновой кислоты, характеризуемый специфической для него последовательностью нуклеотидов, представляющий един ...

Разделы